近日，Microbiome发表了“The facilitating role of phycospheric heterotrophic bacteria in cyanobacterial phosphonate availability and Microcystisbloom maintenance” 研究论文。论文揭示了基于藻-菌互作的蓝藻间接膦酸酯利用机理，并明确了膦酸酯在蓝藻水华优势维持中的生态风险。
研究背景
浮游植物与细菌的相互作用，被认为是水生生态系统中最重要的生物间联系。藻际环境（phycosphere）是藻菌互作发生的主要界面，其定义为浮游植物细胞周围富含其分泌的有机质的区域，是水生细菌的重要微环境。相比于较系统的真核藻类与细菌互作机理解析，蓝藻与异养细菌关系的研究缺乏足够实验验证。膦酸酯是水体溶解性有机磷的重要组成，是一类新近发现的生物可利用磷，构成水体磷氧化还原循环的主要环节；但其在水生生态系统的生物转化过程不甚明晰，对其生态功能亦缺乏足够认识，如尚不明确其在蓝藻水华过程中的作用。前期对蓝藻门膦酸酯利用调查发现（https://mp.weixin.qq.com/s/EnQM47XBF1NVZhlUpYtOYw），仅约6%蓝藻编码膦酸酯利用（C-P键裂解酶）基因簇，且其中逾93%为丝状蓝藻，单细胞蓝藻（如微囊藻）基本不编码相关基因。
近期，华南师范大学束文圣教授团队联合中国科学院水生生物研究所宋立荣研究员团队与暨南大学韩博平教授团队，系统研究了藻际细菌在蓝藻膦酸酯利用中的作用。该研究结合多组学方法与藻类生理学验证，揭示了基于藻菌互作的蓝藻间接膦酸酯利用机理，且其在微囊藻水华优势维持中的重要作用。这一研究明确了膦酸酯在蓝藻水华过程中的生态风险，更为蓝藻水华发生与优势维持机理的解析提供了全新的研究方案。
研究结果
（1）膦酸酯利用异养细菌在实验室培养蓝藻藻际中广泛存在且活跃
对国家水生生物种质资源库淡水藻种库162株带菌蓝藻进行宏基因组测序，组装获得807个高质量（完整度>90%，污染度<10%）细菌bin，包括160个蓝藻基因组bin与647个藻际细菌基因组bin（图1A）。对藻际细菌bin进行膦酸酯利用（C-P键裂解酶）基因簇挖掘，确定其中来源于80株藻的128个bin编码该基因簇（包含来源于32株微囊藻藻际的43个bin）；物种注释结果显示41个bin属于根瘤菌目（Rhizobiales），29个bin属于红螺菌目（Rhodospirillales），25个bin属于红球菌目（Rhodobacterales），11个bin属于假单胞菌目（Pseudomonadales）（图1B）；相关bin在藻际中的丰度从0.21% - 12.87%不等（图1C）。C-P键裂解酶基因phnJ系统发育树显示蓝藻与异养细菌中该基因基本独立成簇，但存在个别蓝藻与异养细菌混合进化枝（图1C），暗示phnJ可能在藻菌间水平转移。
后续以淡水藻种库6株带菌蓝藻培养液为材料（Anabaena lutea FACHB-196, Anabaena sp. FACHB-418, Calothrix membranacea FACHB-236, Nostoc linckia FACHB-391, Nostoc flagelliforme FACHB-838, Nostoc sp. FACHB-973, Microcystis aeruginosa FACHB-905 与Oscillatoria tenuis FACHB-1052），使用筛选培养基分离获得7属22株潜在膦酸酯利用藻际细菌。选择其中6属6株细菌进行膦酸酯利用实验，结果显示这些藻际细菌均可以一种或多种膦酸酯为唯一磷源维持细胞生长；后续在上述藻株基因组中均检测到一个或多个膦酸酯利用通路。
图1 蓝藻藻际中膦酸酯利用（C-P键裂解酶）基因簇的分布与系统进化。A，宏基因组项目中807个（647细菌+160蓝藻）高质量bin的物种组成；B，C-P键裂解酶基因簇在各个细菌目的出现频率；C，蓝藻与藻际细菌phnJ基因系统发育树，最外圈柱状示该细菌在对应蓝藻培养液的相对丰度。
（2）野外微囊藻藻际膦酸酯利用细菌的普遍存在及微囊藻藻际对其富集
基于（1）中藻际细菌高质量基因组数据集，自主设计分别针对根瘤菌目、红螺菌目与假单胞菌目phnJ基因的三对荧光定量PCR引物，并用于26份滇池与太湖微囊藻水华水体总浮游生物样本检测，结果显示三个目的膦酸酯利用细菌在样品中广泛存在，总相对丰度最高可达3.6%（图2A），且丰度与溶解性活性磷浓度存在负相关性。
同时，将上述三对引物应用于8份分粒级微囊藻水华样品（图2B）；在24组检测结果中，16组结果显示膦酸酯利用细菌在微囊藻藻际组分的丰度显著高于其在游离细菌组分的丰度（图2C-E），表明野外水华水体微囊藻藻际对膦酸酯利用细菌存在招募与富集。
图2 太湖与滇池微囊藻水华水体不同组分样品中phnJ基因的丰度。A，26份样品中的环境参数与基因丰度动态变化；B，藻际组成与游离细菌组分定义示意图；C-E，8份分粒级微囊藻水华样品中各组分phnJ基因荧光定量PCR结果。*: p < 0.05; **: p < 0.01.
（3）宏转录组揭示细菌的膦酸酯代谢在微囊藻水华优势维持中的重要作用
对一组太湖微囊藻群体宏转录组数据（PRJNA664620）进行分析，探究磷代谢相关基因动态变化及其与环境因子相关性。结果显示，膦酸酯代谢相关基因在水华期间的持续表达（图3A），表达丰度与磷浓度存在负相关性（图3B）。表明藻际细菌的膦酸酯代谢是水华优势维持过程中微囊藻-细菌集合体对缺磷的重要响应。对phnZ（膦酸酯加氧酶，膦酸酯氧化途径关键基因）进行特异性鉴定，结果显示，甲基膦酸（MPn）特异性phnZ基因与2-氨基乙基膦酸（2-AEP）特异性phnZ基因均持续的表达（图3A），暗示两种水体最主要的生物源膦酸酯是微囊藻-细菌集合体的重要替代性磷源。对鉴定到的phnJ基因进行物种注释，明确红螺菌目、伯克氏菌目以及未分类的α变形菌是藻际膦酸酯利用的主要贡献者（图3C）。
图3 宏转录组揭示了藻际细菌的膦酸酯代谢在微囊藻水华缺磷时期持续表达。A，磷代谢基因表达量变化；B，膦酸酯代谢相关基因与各环境参数相关性网络图；C，phnJ基因表达量与物种注释结果
（4）藻菌共培养实验证实藻菌互作驱动的微囊藻间接甲基膦酸利用
为明确膦酸酯利用细菌在蓝藻磷限制应答中的作用，将无菌铜绿微囊藻PCC 7806与3株膦酸酯利用藻际细菌（391_Methyba4, 905_Psudmo1 及973_Rhizob3）混合形成3个稳定共培养体系。检测体系的甲基膦酸利用能力，结果显示磷饥饿的无菌微囊藻PCC 7806无法利用甲基膦酸维持其生长（图4A）；3个共培养体系均可以甲基膦酸为唯一磷源维持微囊藻增殖（图4B-D），表明微囊藻可以藻菌集合体形式间接利用甲基膦酸；同时共培养体系中甲烷释放增强（图4E-H）。后续对实验过程中培养液的磷浓度（图4I-L）与藻、菌生物量（图4M-O）进行了追踪，初步厘清了其互作机理，即共培养体系先通过细菌甲基膦酸利用实现自身的大量增殖，后期细菌裂解产生的生物可利用磷再维持微囊藻生长。
图4 无菌铜绿微囊藻PCC 7806与3个共培养体系的甲基膦酸利用生理实验。A-D，微囊藻生长响应模式；E-H，四个体系中的甲烷释放模式；I-L，四个体系中甲基膦酸组与正磷酸盐组溶解性总磷（TDP）与溶解性活性磷（SRP）浓度变化模式; M-O，三个共培养体系藻菌相对丰度变化曲线。
总结与展望
本研究首次揭示基于藻菌互作的蓝藻间接膦酸酯利用及其在微囊藻水华优势维持中的作用； 蓝藻藻际是水体膦酸酯利用的热点； 蓝藻藻际对膦酸酯利用细菌的富集是其应对缺磷环境的重要响应； 膦酸酯在蓝藻水华过程中的生态风险应获得更多关注；、
专家点评：浮游植物与藻际细菌的互作对于水生生态系统的运行具有决定性的作用。基于实验验证的蓝藻-藻际细菌研究，是蓝藻生物生态学研究的前沿领域。尽管有大量研究指出，藻际细菌在蓝藻水华发生与维持的作用，但多数研究集中于群落结构与功能的定性描述，缺乏足够的定量实验验证。上述研究结合多组学方法，基于野外观察和实验室培养，揭示了可利用膦酸酯的藻际细菌在微囊藻等蓝藻藻际的分布规律和关键基因表达特征，进一步通过共培养实验，发现在磷饥饿条件下，相关藻际细菌可维持微囊藻在以甲基膦酸为唯一磷源条件下的增殖，证明了膦酸酯在蓝藻水华发生及其优势维持中的重要生态贡献。该研究不仅为藻-菌互作机理的解析提供良好的研究模型，而且为深入揭示蓝藻水华暴发与优势维持机理提供了新的思路，也将促进蓝藻生物与生态学的发展（吴庆龙：中国科学院南京地理与湖泊研究所研究员，国家杰出青年科学基金获得者）。
研究团队及项目资助
论文第一作者赵亮博士来自华南师范大学和中国科学院水生生物研究所；共同第一作者林立洲博士来自中科院水生所与广东省科学院微生物所。华南师范大学束文圣教授、中科院水生所宋立荣研究员、暨南大学韩博平教授为论文的共同通讯作者；美国德州大学UTEX藻种库Jerry Brand教授，国家水生种质库淡水藻种库郑凌凌高级实验师与清华大学陈挺教授等参与了该项工作。研究得到国家自然科学基金（32270114, 31900090, 3201101157 与41830318）、广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515110430）和广东省重点领域研发计划（2019B110205004）的资助。国家水生生物种质资源库淡水藻种库为该研究提供了所有藻种材料（网址：https://algae.ihb.ac.cn/）。