（九）人体染色体分带技术

 

一、实验原理

染色体分带是 20 世纪 70 年代发展起来的技术，它借助特殊的处理程序，使染色体显

现出深浅不同的染色带，染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性，可作为鉴别染色体的重要依据，因此无论在遗传学的研究领域，还是在遗传病的诊断、动植物育种

等应用方面，染色体分带都是很有用的技术。

二、实验目的

学习 C 带和 G 带显示方法。

三、实验材料

1 ．小鼠骨髓细胞染色体标本片。

2 ．人淋巴细胞染色体标本片。

四、实验器具和药品

1 ．器具

恒温水箱、显微镜、立式染缸、温度计、镊子、量筒、烧杯、玻棒、漏斗、过滤纸

250ml 试剂瓶、大培养皿、染色玻璃架、载片盒、砂笔。

2 ．药品及配制 ，

(1)pH 6.8PBS ： Na 2 HPO 4 ， 2H 2 O 5.92g ， KH 2 PO 4 4.5g 蒸馏水 1000ml 。

(2)0.2mol ／ L HCI ： 36 ％ -38 ％浓度的 HCl 6.5ml 加到 983.5ml 蒸馏水中。

(3)5 ％ Ba(OH) 2 溶液： Ba(OH) 2 5g 溶于 100ml 蒸馏水中，过滤 ( 用前配 ) 。

(4)2 × SSC 溶液： NaCl l 7.54g ，柠檬酸钠 8.82g ，蒸馏水 1000ml 。

(5)pH7.0 ICN 液： NaCl 0.80g ， KCl 0.02g ， Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 0.30g ，蒸馏水 100ml 。

(6)pH7.0 IKN ：葡萄糖 0.10g ， KCl 0.04g ， NaCl 0.80g ， NaHCO 3 0.035g ，蒸馏水 100ml 。

(7)0.25 ％ Trypsin 液： 250mgTrypsin 溶于 100mlICN 液中。

(8)Giemsa 原液。

五、实验步骤

1 ． C 带技术

(1) 标本片用金钢砂笔编号后，放入 0.2mol ／ L HCI 的染缸中，室温下处理 15min ～ 30min ，目的足使 DNA 脱嘌岭，但 DNA 骨架末断裂。

(2) 自来水冲洗。

(3) 将洗好的标本片放入 5 ％ Ba(OH) 2 的染缸中于 50 ℃ 水浴处理 10min ，碱处理可能通过产生一个高水平的 DNA 变性，促进 DNA 溶解。

(4) 蒸馏水冲洗。

(5) 在 2 × SSC 溶液巾 60 ℃ 保温 30min ，使 DNA 骨架断裂并使断片溶解。

(6) 蒸馏水冲洗。

(7)1 ： 10Giemsa 染色 10min ， C 带的基本特征是从染色体臂选择性地抽取 DNA ，而 C 带区 DNA 对抽提有较大的抗性，从而保留了一部分 DNA ，因此用 Giemsa 染液巾可显示出 DNA 的不同分布。

(8) 自来水冲洗、干燥。

(9) 镜检：低倍镜下找到分散好的细胞中期分裂相，换油镜仔细观察 C 带特点，如着丝粒区域或异染色质部位、次缢痕及 Y 染色体深染、染色体其它部位浅染，即为可取标本。

2 ． G 带技术

(1) 标本片置 60 ℃ 烘箱中 16h~24h 。

(2) 取烘过的标本置预热到 37 ℃ 的 0 ． 25 ％ Trypsin 液中 0.5min ～ lmin( 处理时间随气温和片冷而异 ) ，近年来的研究表明，用 Trypsin 处理染色体标本是 G 带显示的一种预处理方式，它可以从染色体上抽取蛋白质的特定组成部分。 Giemsa 是噻嗪－曙红染料，染色首先取决于二个分子同 DNA 结合，在此基础上它们结合一个曙红分子，其次取决于有助于染料沉淀物累积的疏水环境，通过 Trypsin 预处理可以使阴性 G 带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变为更疏水状态。由此可见在 G 带中抽取蛋白往往是疏水的，而且主要来自阴性 G 带区．

(3) 用 pH6.8PBS 配制的 5 ％ Giemsa 液染色 10min~20min 。

(4) 蒸馏水漂洗数次，空气干燥。

(5) 镜检：低倍镜下找到分散好的细胞中期分裂相，换油镜仔细观察 G 带，染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本。

六、注意事项

1 ．在 C 带技术中，若观察到染色体均呈白色，可能是碱处理或 2 × SSC 温育过度了。

2 ．在 G 带技术中，若观察到染色体变粗、边缘发毛，有时甚至成糊状，那可能是处理过度了

七、作业

1 ．交 C 带、 G 带标本各一张．

2 ．思考 C 带技术和 G 带技术原理的异同。