(六)植物细胞有丝分裂

 

一、实验目的

(1) 学习和掌握植物根尖细胞压片技术。

(2) 观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化。

二、实验原理

有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式，在有丝分裂过程中，细胞核内的染色体能准确地复制，并能有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞完全一样。从而可推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分配有关，支配生物性状的遗传物质主要存在于细胞核内的染色体上。

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。通过对根尖的固定、染色和压片，可在显微镜下观察到大量处于有丝分裂各个时期的细胞和染色体，看到染色体的变化特点和染色体的形态特征，进行染色体计数。为了获得更多的中期染色体图像，可以采用药物处理或冷冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期，同时还可以使染色体缩短，易于分散，便于观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酸处理除去细胞之间的果胶层，并使细胞软化，便于细胞彼此分开，有利于压片和染色。

三、实验材料

小麦 ( Triticum Spp ． ) 、玉米 ( Zea mays ) 、大蒜 ( Aillumsativum ) 、洋葱 (Aillum cepa ) 、蚕豆 (Vicia faba ) 等。

四、实验器具和药品

1 ．器具 冰箱，恒温箱，显微镜，水浴锅、分析天平、扭力天平、电炉、温度计、剪刀、镊子、刀片、量筒、量杯、三角瓶、烧杯、漏斗、培养皿、酒精灯、滴瓶、载玻片、盖玻片、滤纸、标签、胶水等。

2 ．药品 无水酒精、 95 ％酒精、 70 ％酒精、 45 ％酒精、 0.5 ％醋酸洋红、 0.5 ％苏木精液、 4 ％铁明矾液、苯酚，亚硫酸、二甲苯、秋水仙素、对二氯苯、 8- 羟基喹啉、α－溴萘、 lmol/L 盐酸、 25 ％纤维素酶和 2.5 ％果胶酶混合液、加拿大树胶等。

五、实验步骤

1 ．培养

(1) 大蒜和洋葱根尖：将大蒜或洋葱置于盛清水的小烧杯口上，使根茎部与水接触，然后转移到 25 -28 ℃ 的条件下培养．待根尖长到 2cm 左右时，在上午 9 － 10 时剪去根尖约 lcm 备用。

(2) 玉米或小麦，蚕豆根尖：用温水将蚕豆种子浸种 2 天，玉米及小麦种子浸种 1 天，侍吸水膨胀后转移到铺有几层吸水纸的培养皿或塘磁盘中，上面盖双层湿纱布并加入少许水，放在 25 -28 ℃ 条件下培养．待根尖长到 2cm 左右时．在上午 9 一 l0 时或下午 3-5 时取下根尖备用。

2 ．预处理 为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应对剪下的根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制和破坏纺锤丝的形成．促使染色体缩短和分散。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。

(1) 低温预处理：将剪取的根尖浸入盛有蒸馏水的烧杯内，置于 4 ℃ 的冰箱中进行低温处理 24 小时。此法效果很好。对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀．简便易行，各种作物都适用。

(2 ) 药物预处理：常用药物有秋水仙素溶液、对二氯苯溶液、 8 —羟基喹啉等。

3 ．固定 借助于物理方法或化学药物的作用，迅速渗入组织和细胞将之杀死，使其形态结构和内含物尽可能保持生活时的完整和真实状态。固定时，将预处理过的根尖用蒸馏水冲洗两次 ( 约 5 分钟 ) 。然后移入卡诺氏固定液中，在 4 — 15 ℃ 条件下固定 20 一 24 小时后用 70 ％酒精冲洗 2 次转入 70 ％酒精中．在 4 ℃ 冰箱内保存，保存时间最好不超过二个月．经过较长时间保存的材料，进行观察前可以换用固定液再处理一次效果较好。或将预处理过的根尖放入 0.075mol/L KCI 溶液中低渗 20 分钟．然后在蒸馏水中冲洗 2 — 3 次 ( 约 10 分钟 ) 待用。

4 ．解离 使分生组织细胞间的果胶质分解．细胞壁软化或部分分解．使细胞和染色体容易分散压平。解离有酸解和酶解两种方法：

(1) 酸解：将根尖从固定液中取出，用蒸馏水漂洗．然后放入已经在 60 ℃ 水浴锅中预热的 1 mol/L HCI 中，在 60 ℃ 恒温条件下解离 10 — 15 分钟，当根尖透明呈米黄色时取出，用蒸馏水冲洗 2 — 3 次。

(2) 酶解：将根尖从固定液中取出，放在 0.1mol ／ L 醋酸钠中漂洗，用刀片切除根冠以及延长区 ( 根尖较粗的蚕豆，可以把分生组织切成 2-3 片 ) ，把根尖分生组织放到醋酸钠配制的 2.5 ％的纤维素酶和果胶酶的等量混合液中．在 25 — 28 ℃ 条件下处理 4 — 5 小时。此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉．再滴上 0.1 mol ／ L 醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再放入 45 ％醋酸。

5 ．后低渗 将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗 2 — 3 次 ( 约 10 分钟 ) 。酶解后的根尖放入蒸馏水中浸泡 10 － 15 分钟，然后再冲洗 2 — 3 次。一定要冲洗干净，否则影响染色。低渗后的根尖放入 70% 酒精后备用。

6 ．染色与压片

(1) 醋酸洋红染色制片：取一处理好的根尖置于载玻片中间，用吸水纸吸去多余的保存液，用刀片将根尖分生组织切 1 ：。将其切成薄片，加一小滴醋酸洋红染色液．约 5 分钟后加盖玻片。用吸水纸放在盖玻片上面，左手按住载玻片，用右手拇指在吸水纸上对准根尖部位施加压力。或用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片即可，使材料均匀分散，细胞分离压平。压力要适当，注意不要移动盖片。为增强染色效果，可将载玻片在酒精灯上稍加热，但不使其沸腾。以免染料沉淀。加热的作用不仅可以使材料软化和易于着色．而且可以破坏部分细胞质，使核和染色体有一个比较清爽的背景。如果整个细胞染色较浅，可沿盖片一侧，滴加少许染色液，使其慢慢渗入．放置片刻再进行加热，如此反复进行染色。

醋酸洋红常用于染色体的临时制片，其着色不强，分色效果也不甚佳，故不宜制作永久制片，

(2) 醋酸地衣红染色制片：由于地衣红很容易溶于酒精。所以材料从保存液中取出后，应当充分洗净后浸入 45 ％醋酸中再进行染色。染色时，将材料置于小试管中，加入含盐酸的 2 ％地衣红使材料浸没，在酒精灯上加热 2 － 3 秒钟．静置约半小时或更长时间，取出材料置载玻片上，加一滴不含盐酸的 l ％醋酸地衣红染色液。如醋酸洋红法操作进行压片。地衣红染色液染色，着色力比洋红强，染色较深，尤其对根尖等体细胞染色体的染色比洋红更显优越。

(3) 铁矾—苏木精染色制片法：这是用在根尖细胞有丝分裂染色体计数中效果最好的一种方法，对各种植物的染色体均可染上较深的颜色，分色清晰，照像效果较好．利于标本长期保存。

将解离冲洗后的材料置于 4 ％的铁矾水溶液中染色 2 — 4 小时，如加温 (30 一 40 ℃ ) 媒染，则可缩短至 0.5 － 1 小时。换水洗涤 4 － 5 次．每次约 5 分钟，务必将残留的铁矾充分洗净。再置于 5 ％苏木精水溶液中染色 2 － 4 时。如在染色时发现染色液混浊，则表示铁矾未洗净，需重新放入水中洗涤后再行苏木精染色。染色后的材料用水冲洗 5 — 10 分钟左右，移入 45 ％的醋酸内进行分色和软化 10 一 20 分钟，方可压片。压片时，用镊子取根尖置于载玻片上，切下根尖分生组织。将其切成薄片，滴一小滴 45 ％的醋酸，迅速捣碎根尖，加盖玻片压片，具体方法同醋酸洋红法。

铁矾—苏水精染色时，媒染要充分，媒染后水洗要彻底；在此基础上，苏木精染色也要充分，醋酸分色软化要适宜，位染色体成深兰色，而细胞质退淡。

7 ．境检 压好的片子先在低倍镜下观察，可观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体。选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意细胞核及染色体，纺缍体等的变化动态。

8 ．制备永久片

六、实验作业

(1) 制作 1 一 2 张合格的有丝分裂玻片，交 1 — 2 张注明分裂时期及染色方法的永久制片。

{2} 绘制 2 － 4 张有丝分裂时期的简图。