(五)果蝇唾液腺染色体观察

一、实验目的

(1) 练习剖取果蝇三龄幼虫唾液腺的方法。

(2) 掌握制作果蝇唾液腺染色体标本的技术

(3) 观察果蝇唾液腺染色体的形态特征。

二、实验原理

1881 年意大利的细胞学家巴尔比尼 (Balbiani) 在双翅目昆虫摇蚊 ( chironmus ) 幼虫的唾液腺细胞间期核中发现了一种巨大染色体。由于存在于唾液腺细胞，所以又称为唾液腺染色体。 1933 年美国学者贝特恩 (Painter) 等又在果蝇和其它双翅目昆虫的幼虫唾液腺细胞间朋核中发现了巨大染色体。

果蝇三龄幼虫的唾液腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态．在幼虫发育过程中细胞核中的 DNA 多次复制，但细胞、细胞核不分裂。复制后的染色单体 DNA 不分开，这种现象叫做核内有丝分裂，从而形成了多线染色体。加之唾液腺细胞中同源染色体互相靠拢在一起呈现一种联会状态，而使其比一般体细胞中的染色体粗 1000 — 2000 倍，长 100 － 200 倍。

由于在唾液腺细胞中 8 条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的 5 条染色体臂。在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称做明带、暗带的横纹，这些横纹的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性。不同物种，不同染色体的不同部位形态位置是固定的。因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确识别各条染色体。在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼氏环，其富含转录出来的 RNA ，因此不着色，是基因活动的区域。在个体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼氏环在染色体上出现的部位不同，据此研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。

四、实验器具和药品

1 ．器具 双筒解剖镜、显微镜、镊子、解剖针，载玻片、滤纸、培养皿、酒精灯．

2 ．药品 醋酸洋红染液、生理盐水 (0.7 ％ NaCl) 蒸馏水、固定液（冰醋酸：乙醇＝ 3 ： 1) 、 lmol ／ L HCI 、乙醇 (100 ％、 95 ％ ) 、加拿大树胶。

五、实验步骤

1 ．材料准备 发育充足、肥大的三龄幼虫，唾液腺和唾液腺细胞发育良好。利用这样的唾液腺细胞才能制备出理想的染色玻片标本。因此要求培养基营养丰富，含水量较高。比较松软，发酵良好。

将果蝇放入培养瓶 ( 果蝇不应过多，半磅牛奶瓶 10 对左右于 15 － 16 ℃ 的稍低温度条件下培养，接种 12 小时后，将成虫移出，控制成虫的排卵持续时间，以免产生过多的卵 ( 要求每 cm 2 养基表面 20-40 只幼虫 ) ，一龄幼虫出现后，每天在培养基表面加 2 ％一 5 ％的酵母液 ( 或鲜酵母 ) 。 2 － 3 龄幼虫期应滴加 10 ％左右的酵母液，滴加的量以复盖在培养基表面薄薄一层为宜。待三龄幼虫大量爬出培养基时，也可将培养瓶移至 3 － 5 ℃ 冰箱中放置 12 或 24 小时，进行低温处理，以获得染色体分散良好的制片。

2 ．剥离唾腺 在一干净载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。由于果蝇的唾液腺位于幼虫体前 1 ／ 3 － 1 ／ 4 处，所以在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端 1 ／ 3 处。固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器处，适当用力向后拉，把头部与身体拉开，唾液腺腺体随之而出。把载玻片移到显微镜下查找唾液腺。果蝇的唾液腺是位于口器后端神经节两侧的一对透明而微白的类似香蕉形的长形小囊，由单层细胞构成。细胞大，细胞核大，细胞轮廓清晰。用解剖针先将含有腺体的一团组织与其它组织分开．然后再将腺体与脂肪等组织分开．剖离腺体也可在解剖镜下进行．

3 ． 解离 将唾液腺在载玻片上滴一滴 lmol ／ L HCI ，让唾液腺在 lmol ／ LHCI 中解离 2 － 3 分钟，以松软组织，利于染色体分散。

4 ． 染色 解离后的腺体可用水冲洗 2--3 次后滴加醋酸洋红染液染色 20 分钟 ( 解剖和染色过程勿使腺体于燥 ) 。在酒精灯上加热以增强染色效果。可以不经解离一步而直接染色，也可以在将灿幼虫头部与身体拉开后马上加染液染色，然后慢慢剖离腺体．

5 ．滴片 当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色沉淀物，然后加上盖玻片，在盖玻片上方再植盖一层滤纸，用镊子在盖玻片，轻轻敲击几下。再用拇指按住盖玻片用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开．压片时放载玻片的桌面要干，不要使盖片滑动。制好的玻片标本用蜡封住盖玻片四周以防干燥。经低温冷冻处理的材料经解离，染色．加盖片后不必敲击．镜检即可看到分散良好的染色体。

6 ．观察 将制好的片子先用低倍显微镜观察。找到好的染色体于视野中心，再用高倍镜观察之。如果制片理想，可做成永久制片。

六、实验结果

一般实验用的普通果蝇 ( Drosophila melanogaster 2n ＝ 8) ，其中一对为性染色体 (XY 或 XX) ， xx 染色体为端着丝粒染色体，呈杆状， Y 染色休为” J ”形；第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色休，呈‘ V ”形；第四对染色体短小，为端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。由于唾液腺染色体的假联会， x 染色体的一端在异染中心上．另—端游离；而第二，第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“ V ”字形向外伸展出四条臂 ( 2L 、 2R 、 3L 、 3R) ， Y 染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成，所以理想的片子不管雌雄果蝇的唾液腺细胞在显做镜下均可见五条长臂 (x 、 2L 、 2R 、 2L 、 3R) 和一条短臂 ( 第四条染色体臂不易观察 ) 。雄果蝇唾液脏细胞中的 x 染色体臂比雌果蝇的稍细。在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。

七、实验作业

绘制你所观察到的果蝇唾液腺染色体图，示各臂末端 5-10 条带纹，并注明是第几条染色体褐臂的左右。