(十四)细菌转导
一、实验目的
㈠掌握细菌转导实验的操作方法和技术。
㈡进一步理解转导的基本原理和验证 DNA 是遗传物质。
二、实验原理
转导指以噬菌体作媒介将某一供体细菌的 DNA 片断导入另一受体细胞的过程。转导可以分为普遍性转导和局限性转导。普遍性转导指噬菌体能转导供体细菌的任何基因，如鼠防寒沙门氏菌的 P22 噬菌体、大肠杆菌的 P1 噬菌体，枯草杆菌的 PBS1 、 PBS2 、 SP10 噬菌体等都为普遍性转导噬菌体，其机制在于这些噬菌体可以整合在供体菌染色体 DNA 的任何位位上。局限性转导指噬菌体只能转导供体菌染色体 DNA 上的某些特定基因，如 A 噬菌体只能转导 E.coliK12 染色体 DNA 上的半乳糖基因 (gal) 和生物素基因 (bio) 。产生局限性转导的原因在于这些噬菌体仅能整合在供体菌染色体 DNA 的特定位置上。
转导实验中常用的是 λ 噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体 DNA 上的半乳糖基因 (gal.17 分钟处 ) 与生物素基因 (bio.18 分钟处 ) 之间，因此，它能转导 gal 基因又能转导 bio 基固。选用溶源性的 E.coliK12 （ λ） gal + 为供体菌。由于在此供体菌中 λ噬菌体 与 gal + 基因 紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线照射后产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有 gal 基因的转导噬菌体。当让这种转导噬菌体与受体菌 E.coliK12S gal - 混合接触时，带有供体菌 gal + 基因的转导噬菌体能以一定的频率整合到受体菌的染色体 DNA ，而使不能利用半乳糖的 gal - 受体菌转变成了能利用半乳糖的 gal + 细菌。
三、实验材料
(1) 供体菌： E.coliK12 （ λ） gal +
(2) 受体菌： E.coliK12S gal -
四、实验器具和药品
1 ．器具 培养皿、试管、离心管、三角烧瓶 (100 — 150mL) 、涂棒、离心机、吸管 (0.1 、 1.0 、 5.0mL) 、水浴锅、紫外线照射箱、温箱、接种环、酒精灯。
2 ．药品 肉汤液体培养基，肉汤固体培养基、 2E 肉汤液体培养基、肉汤半固体琼脂培养基、半乳糖 EMB 培养基、 pH7.0 — 7.2 磷酸缓冲液、氯仿。
五、实验步骤
• 获取转导噬菌体
⑴供体菌活化：取一环供体菌接种于盛有 5mL 肉汤液体培养基的三角烧瓶中， 37 ℃ 培养 16 小时使供体菌活化。
⑵ 供体菌培养：用吸管吸取 0.5mL 经活化后的菌液接种于盛有 4.5mL 肉汤液体培养基的三角烧瓶中， 27 ℃ 培养 4 — 6 小时。
(3) 制备菌悬液：将 37 ℃ 培养 4 — 6 小时后的菌液倒入离心管中，以 3500rpm 离心 10 公钟，慢慢弃去上清液后再用吸管加入 4mL 磷酸缓冲液．用吸管把沉淀吹打均匀，以 3500rpin 离心 10 分钟，反复三次以洗净菌体，最后制成菌悬液。
(4) 诱导裂解：用吸管吸取 3ml 菌悬液于培养皿中，然后把加有盖子的培养皿移到 15W 的紫外灯下 ( 培养皿距紫外灯垂直距离为 40cm ) 照射 30 秒钟，用手轻轻摇动一下培养皿，打开培养皿盖子继续照射 10 一 20 秒钟以诱导噬苗体裂解供体菌。
(5) 避光培养：经紫外线诱导后在培养皿中加入 3mL2E 内汤液体培养基．为了防止光复活，把培养皿用黑纸包好．然后放在 37 ℃ 无光条件下培养 2 — 3 小时。
(6) 制备裂解液：用吸管吸取培养物于离心管中，以 3500rpm 离心 10 分钟，吸取上清液于另一支离心管中 ( 沉淀物弃去 ) ，在此离心管中加入 0.2mL 氯仿（约 4 — 5 滴）。把离心管放在震荡器上剧烈振荡 30 秒钟，再静代置 5 分钟后把上清液吸入到另一试管中，在此试管中的上清液就呈噬菌体（ λ） gal + 的裂解液。
2 ．噬菌体效价测定
(1) 受体菌活化：用接种环挑取一环菌体置接种于盛有 5mL 肉汤液体培养基的三角烧瓶中， 37 ℃ 培养 16 小时。
(2) 受体菌培养：从活化后的受体菌培养液中吸取 0.5mL 放入盛有 4.5mL 肉汤液体培养基的三角烧瓶中， 37 ℃ 培养 4 — 6 小时以作指示菌用。剩余的 4.5mL 活化后的受体菌培养液放入 4 ℃ 冰箱中供后面涂布转导时用。
(3) 受体菌接种：取试管 4 支，每支中加入 3mL 已经溶化并于 45 ℃ 保温的肉汤半固体琼脂培养基，每支试管中再加入指示菌液 0.5mL 。
(4) 稀释噬菌体裂解液：吸取 λ 噬菌体裂解液 0.5mL 加入到含；有 4.5mL 肉汤液体培养基的试管中，依次稀释到 10 -7 。
(5) 计算效价：从稀释成 10 -8 、 10 -7 的试管中分别吸取 0.5mL 噬菌体裂解液加入到含有指示菌液的肉汤半固体琼脂培养基的试管中，每个稀释度 2 支试管，摇匀后分别倒入盛有已凝固的内汤固体培养基的培养皿中，摇匀待凝固后， 37 ℃ 培养过夜。第二天观察每个培养皿中出现的噬菌斑数，同时计算噬菌体裂解液的效价，噬菌体裂解液的效价等于每毫升中 λ 噬菌体的总数。即
效价 ( 噬菌斑数／ mL) ＝两皿平均斑数×稀释倍数×取样量折算数。
3 ．转导试验
⑴培养皿底部绘图：取盛有半乳糖 EMB 培养基的培养皿 2 只，用红色或兰色玻璃铅笔在培养皿底背面画两条宽带和上下两个圆圈，并在每条宽带上画两个方格。
(2) 受体菌活化：取噬菌体效价测定第 2 步中保存于 4c 冰箱中的受体菌菌液转放到 37 ℃ 培养精中培养 16 小时。
⑶受体菌接种：用接种环挑取一满环受体菌，在培养皿中已画好的两条宽带内涂出 2 条菌条， 37 ℃ 培养 1.5 小时。
(4) 滴加噬菌体：从培养箱中取出培养皿，在培养皿底部画二个圆圈、四个方格的地方各加一环噬菌体裂解液，先滴加二个圆圈处作为 λ 噬菌体对照，后滴加四个方格处作为转导试验。宽带中四个方格以外的菌条作为受体菌对照， 37 ℃ 培养 48 小时。
(5) 观察：培养 48 小时后观察四个方格以外的受体菌的菌落生长情况和菌落的色泽，同时也观察 4 个方格中以及 2 个圆圆中菌落生长情况和菌落色泽。也可以用涂布法作转导试验，其步骤是光取倒好半乳糖 EMB 培养基的培养皿 6 套，将其编号 1 、 2 、 3 、 I 、 5 、 6 号， 2 号皿中仅滴加 0.1 mL 噬菌体裂解液作为对照， 3 号、 4 号皿仅滴加 0.1 mL 受体菌菌液作为对照， 5 号、 6 号皿中滴加噬菌体裂解液 0.05 mL 受体菌菌液。用玻璃涂棒将 6 只培养皿中的滴加物均匀涂开， ( 每 2 只相同的皿用同一只涂棒 ) 37 ℃ 培养 48 小时后观察结果。
六、实验结果
若实验操作正常，滴加法使在涂的 2 个宽带菌条中菌落呈粉红色，在四个方格中菌落呈紫褐色且具金属光泽，在 2 个圆圈中没有菌落出现。将噬菌体效价测定结果填入下列表格中。
噬菌体效价测定结果
噬菌体来源 |
裂解液稀释度 |
取样量 |
噬菌斑数 / 皿 |
噬菌体数 /mL |
噬菌体裂解液 |
10 -6 |
0.5 mL |
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10 -7 |
0.5 mL |
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细菌转导试验结果
转导试验 |
点滴法 |
涂布法 |
受体菌 |
噬菌体裂解液 |
受体菌 + 噬菌体裂解液 |
受体菌 |
噬菌体裂解液 |
受体菌 + 噬菌体裂解液 |
菌落生长情况 |
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菌落色泽 |
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