（十三）粗糙链孢霉的四分子分析
一、实验原理
粗糙链孢霉 ( Neurosporocrassa ) 属于真菌中的子囊菌纲，它是进行四分子遗传学分析的好材料，其菌丝体是单倍体 (n ＝ 7) ，每一菌丝细胞中含有几十个细胞核，由菌丝顶端断裂形成分生孢子，分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分尘孢子中含有几个核，分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这就是粗糙孢霉的无性生殖过程。
粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型 (mating type) ，用 A 、 a 或 mt + 、 mt - 表示，它们受一对等位基因控制，不同接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这个过程称为有性生殖。有性生殖可以通过两种方式进行：
(1) 当菌丝在有性生殖用的杂交培养基上增殖时，就会产生许多原子囊果，内部附有产囊体。若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。钩状细胞顶端的二个核形成合子，合子核再进行减数分裂，成为四个单倍体的核，就是四分体。再进行一次有丝分裂，变成八个核，顺序地排列在一个子囊中，原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子囊果，一个子囊果中集中着三十到四十个子囊。成熟的子囊孢子呈橄榄球状，比分生孢子要大得多，子囊孢子如经 60"C 处理 30min~60min ，便会发芽，长出菌丝，再度开始无性繁殖。
(2) 不同接合型的菌株的苗丝连接，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，产生子囊果。粗糙链泡霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它萌发成的菌丝体也是单倍体，所以一对等位基因决定的性状在杂交子一代中就能分离。在粗糙链孢霉中，一次减数分裂的产物包含在一个子囊中，所以很容易看到一次减数分裂所产生的四分子中一对基因分离，并证明基因在染色体上，同时由于 8 个子囊孢子顺序地排列在子囊中，就可以测定着丝粒距离并发现基因转变 (gene conversion) ，若两个亲代菌株有某一遗传类型， 4 个子囊孢子属于另一类型．它们的分离比例是 1 ： 1 ，而且子囊孢子按一定顺序排列，如果这一对基因与子囊袍子的颜色有关，那么在显微镜下可以观察到于囊孢子的不同排列方式。
本实验用赖氨酸缺陷型 ( 记作 Lys - ) 与野生型 ( 记作 Lys + ) 杂交，得到的子囊孢子分离为 4 个黑的 (+) ， 4 个灰的 (-) ，黑的孢子是野生型，赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色，根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有 6 种子囊类型。
① + + + + - - - -
② - - - - + + + +
①②属第一次分裂分离子囊
③ + + - - + + - -
④ - - + + - - + +
⑤ + + - - - - + +
⑥ - - + + + + - -
③④⑤⑥属第二次分裂分离子囊
子囊型①和②的第一次减数分裂 (M1) 时，有 Iys + 的两条染色单体移向一极，而带有
Lys - 的两条染色单体移向另一极， Lys + ／ Lys - 这对基因在第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离 (first division segregation) 。第二次减数分裂 (M2) 时，每一染色单体相互分开，形成
四分体，顺序是 ++-- 或 --+++ ，再经过一次有丝分裂，成为①和②的子囊型，形成这两种子囊型时，在着丝粒和基因对 Lys+ ／ Lys - 间未发生过交换，是第一次分裂分离子囊。
子囊③和④的形成，是由于 Lys 基因与着丝粒问发生了一个交换， Lys+ ／ Lys - 在第一次减数分裂时没有分离，到第二次减数分裂 (M2) 时，所有 Lys+ 的染色单体才和所有 Lys - 染色单体相互分开，所以称为第二次分裂分离 (second division segregation) 。然后再经一次有丝分裂形成 4 个孢子对，顺序是 ++--++-- 或 --++--++ ，这是第二次分裂分离子囊。
⑤和⑥子囊型的形成与③和④类似，也是两个染色体发生了交换，不过交换不是发生在第二条染色单体和第三条染色单体之间，而是发生在 1 ， 3 或 2 ， 4 两条染色单休之间。从以上的分析可知，第二次分裂分离子囊的出现，是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果，第二次分裂分离子囊愈多，则有关基因和着丝粒之间的距离愈远，所以由第二次分裂分离子囊的频度可以计算某一基因和着丝粒之间的距离，称为着牲粒距离，因为交换在两条染色单体之间发生而与另外两条无关，而每发生一次交换产生一个第二次分裂分出子囊，所以求出第二次分裂分离子囊在所有子囊中占的比例，再乘以 1 ／ 2 ，就可以决定某一基因与着丝粒间的重组值。重组值除去％，即作为图距。
二、实验目的
通过对粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表现型的分析，了解顺序排列的四分子的遗传学分析方法，进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。
三、实验材料
• 粗糙链孢霉野生型菌株， Lys + ，接合型 A 。
• 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株， Lys - ，接合型 a 。
四、实验器具和药品
1 ．器具：显微镜、恒温培养箱、高压灭菌锅、电炉、镊子、解剖针、接种针、载玻片、
试管、培养皿、牛皮纸、粗棉线、滤纸、酒精灯、烧杯、漏斗、铁圈、铁架、玻棒。
2 ．培养基
(1) 基本培养基 ( 野生型可生长，缺陷型不能生长 ) ：
50 倍浓度的贮存液：
(Na 3 C 6 H 5 O 7 ·2H 2 O) 125g
KH 2 PO 4 250g
NH 4 NO 3 l 00g
MgSO 4 ·7H 2 O 10g
CaCl 2 ·2H 2 O 5g
生物索溶液 (5mg ／ 100m 1) 5m 1
微量元素溶液：
柠檬酸· 2H 2 O 5g
ZnSO 4 ·7H 2 O 5g
Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 · 6H 2 O 1g
CuSO 4 · 5H 2 O 0.25g
MnSO 4 · H 2 O 0.05g
H 3 BO 3 ， 0.05g
Na 2 MnO 4 · 2H 2 O 0.05g
蒸馏水 100m 1
氯 仿 1m 1
以上微量元素溶液成分各取 10m 1
蒸馏水 1000rnl
氯 仿 2 m 1~3ml
用前稀释贮存液，再加 1.5 ％的蔗糖， pH5.8 ，如加 2 ％琼脂，即成基本固体培养基。
(2) 补充培养基：在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、维生素等，氨基酸用量一般是 100m 1 基本培养基中加 5mg~10mg 。
本实验所用的补充培养基只要在基本培养基中加适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。
(3) 完全培养基
基本培养基 1000ml
酵母膏 5g
麦芽汁 ( 亦可不加 ) 5g
酶解酪素 1g
维生素混合液：
硫胺素 10mg
核黄素 5mg
吡哆醇 5mg
泛酸钙 50mg
对 - 氨基苯甲酸 5mg
菸酰胺 5mg
胆 碱 100mg
肌醇 100mg
叶 酸 7mg
以上维生素混合液成分各取 10m 1
蒸馏水 1000ml
蔗 糖 20g
( 为获得大量分生孢子，可用 1 ％的甘油代替蔗糖。 )
如加 2 ％琼脂，即为完全固体培养基．
(4) 麦芽汁培养基：可以代替完全培养基．配方简单．麦芽汁 2 份，蒸馏水 1 份．再
加 2 ％琼脂。
(5) 马铃薯培养基：也可代替完全培养基，将马钤薯洗净去皮，切碎，取 200g ，加水
1 000ml ，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加 2 ％琼脂， 20g 蔗糖煮融分装到试管中，也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每只试管放 3 — 4 粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。
(6) 杂交培养基
KH 2 PO 4 1g
MgSO 4 ·7H 2 O 0.5g
KNO 3 1g
NaCl 0.1g
CaCl 2 ·2H 2 O 0.13g
生物素 20μg ( 或 5mg/100ml 溶液 0.4ml )
微量元素溶液 lml
( 成分同基本培养基中微量元素液，配成 4 倍浓度的溶液稀释使用。 )
蒸馏水 1000ml
蔗糖 20g
pH6.5 ，加 2 ％琼脂即成固体培养基
(7) 玉米培养基
将玉米在水中浸软，每只试管放 2 ～ 3 粒，加入 3ml~4ml 溶化好的琼脂 ( 2g 琼脂加 100ml 水 ) ．
上述培养基分装到试管后，加上棉塞，高压灭菌 20min ，取出摆成斜面。
• 药品： 5 ％次氯酸钠 (NaClO) 。
五、实验步骤
1 ．菌种活化
为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化，从冰箱中取出野生型和赖氨酸缺陷型菌种，分别接到两只完全培养基的试管斜面上， 25 ℃ 温箱培养 5 天左右，使菌丝的上部产生分生
孢子。
2 ．杂交
将已活化的两个菌种的分生孢子或菌丝接在同一只玉米培养基上，共接 2 只，放入已灭菌的折叠滤纸 ( 约长 3cm ~ 4cm ) ，贴上标签， 25'C 温箱进行混合培养，杂交后 5 — 7 天就能看到棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果， 7 ～ 14 天左右在显微镜下观察。
3 ．显微镜观察
(1) 在培养皿内倒入 1/3 左右 5 ％的次氯酸钠。
(2) 用镊子将杂交管中的折叠滤纸小心取出，浸泡到次氯酸钠溶液中。
(3) 挑出成热子囊果 ( 大而黑的 ) 放到载片上，用另一载片盖上，压片。因子囊果较硬，用盖玻片盖，压片时盖片易破碎。将压好的片子放显微镜下 (10 × 15 倍 ) 检查，即可见到 30 ～ 40 个子囊，然后再现察子囊孢子的排列情况。
六、实验结果说明
1 ．在每一个子囊中，赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟而呈黑色时，赖氨酸缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同子囊类型．但是如果观察时间选择不当，就不能看到好的结果。观察时间过早，八个子囊孢子都未成熟，全为灰色；观察时间过迟，赖氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了，全为黑色，就不能分清各种子囊类型，所以在子囊形成期间，要预先了解于囊孢子的成熟情况，选择适当时日期进行显微镜观察。
2 ．有时观察到的子囊孢子的排列为 + + + + + + - - ， - - - - - - + + ， + + + + + - - - ， - - - - - + + + ，即为 6 ： 2 或 2 ： 6 的分离比和 5 ： 3 或 3 ： 5 的分离比，排除上面的原因外，这种情况的出现是由于基因转换造成的，基因转换的频率因基因位点不同而异，但一般在 1 ％左右．
3 ．本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为 Lys5 ，其基因位于第六连锁群，着丝粒距离约为 14.8
图距单位。
七、注意事项
在菌种活化及杂交叫要注意无菌操作，杂交结果观察时注意选择时间。
八、作业
观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，填入下表，计算 Lys 基因的着丝粒距离，绘遗传围，写实验报告。
子囊类型 |
观察值 |
+ + + + - - - -
- - - - + + + +
+ + - - + + - -
- - + + - - + +
+ + - - - - + +
- - + + + + - - |
|
合计 |
|