（十二）人体微量血细胞培养 ( 全血培养 ) 及染色体制片

 

一、原理

在正常情况下哺乳动物的外周血中是没有分裂相的，只有在异常的情况下才能发现。低等动物如在两栖类的外周血中也只是偶尔能见到分裂相。

1960 年 Nowell 和 Morhead 证验，用来使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物血球凝

素 (Phytohemagglutinin ， PHA) ，它是人和其它动物淋巴细胞的有丝分剃的刺激剂。在 PHA 的作用下，原来处于 G 0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进行有丝分裂，因而可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。

淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，此后的步骤同于骨髓染包体制片程序。但本实验将更多地介绍一些空气干燥法的细节，以使初学读者能有更多的了解。

人体微量血培养是最简单的淋巴细胞培养的方法。采取微量的末稍血，在 PHA 的作用 下，进行短期培养，便可获得丰富的具有分裂相淋巴母细胞。微量末稍血培养具有操作简 单，用血量少的优点，因此在临床的染色体诊断上是经常使用的一种获得有丝分别相的方 法．

其他动物布制备染色体时也可以采用这种方法，但应根据对象进行适当的改动。即使是 人体的外周血，在培养时也会由于个体差异、培养的条件及操作者本人的经验而又有相当的差异。

二、器材和试剂

（一）器材

静脉取血装置或采血耳针； 20 毫升培养瓶；吸管；注射器、 5 号针头； 10 毫升刻度离心管；载玻片和盖片；显微镜；恒温箱，离心机。

（二）试剂

1 ．培养基：

199( 或 Eaglel's MEM ； RPMI 1640) 4 毫升

小牛血清 1 毫升

PHA 1 ％， ( 广州医药制品研究所 ) 0.075 毫升

盐水提取法自制 PHA 10 ％ 0.1 毫升

双抗： ( 青霉素 l 万单位／毫升，链霉素 1 万单位／毫升 ) 0.04 毫升

用 4%NaHC0 3 调至 pH 7.2 。 PHA 1% 和 PHA 10% 任选一种。

2 ．肝素生理盐水配成 500 单位／毫升

3 ．秋水仙素 4 微克／毫升。

( 以上溶液高压灭菌 )

4 ． 0.075 M KCl

5 ．甲醇

6 ．冰醋酸

7 ． 0.01M 磷酸缓冲液 (PBS) ， pH 6.8

8 ． Giemsa 原液

三、实验步骤

1 ．用经肝素湿润的 2 毫升注射器，自静脉或耳垂、手指取血 0.5-1.0 毫升。

2 ．每 5 毫升培养基中加全血 0.3-0.4 毫升，塞紧瓶塞后置 37 ℃ 箱中培养 72 小时。

3 ．秋水仙素处理：培养至 68 小时左右，在火焰保护下加适量秋水仙素 ( 用 1 毫升注射器， 5 号针头 ) ，每毫升培养基中加一滴 4 微克／毫升的秋水仙素溶液，使终浓度为 0.05 微克 / 毫升培养基，以使细胞抑止在分裂中期。摇匀后，继续培养 4 小时即可进行染色体制片。适量的秋水仙素，适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。这将影响分裂相的多少和染色体的长短。

4 ．低渗处理：用吸管温和吹打细胞悬液，移入 10 毫升离心管中， 1000rpm 离心 10 分钟 ( 或 3500rpm 离心 1 分钟 ) ，弃上清液。加入少量预热 ( 37 ℃ ) 的 0.075MKCl ，吹打成细胞悬液后，加入预热的低渗液 6 － 8 毫升， 37 ℃ 低渗处理 25 分钟。

在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞。

5 ．固定：

预固定：低渗处理后，向低渗液中加入新鲜配制的 1 － 2 毫升固定液 (3 ： 1 ＝甲醉：冰醋酸 ) 进行预固定，以防上低渗处理后的细胞在离心时结团。固定液要沿管壁缓缓加入，然后用吹气的方法混匀。

第一次固定：预固定 1-2 分钟后，离心去上清液 ( 离心速度同上 ) 。然后向离心管加入 0.5 毫升左右的固液，将细胞轻轻吹打成细胞悬液后，加固定液 3--5 毫升。混匀后固定 15-30 分钟。

第二次固定：离心后去上清液，加固定液 3--5 毫升，混匀后固定 15 － 30 分钟。

第三次固定：操作同前。第三次固定后，经离心后去掉大部上清液，只留 0.1-0.2 毫升固定液，混匀后即可滴片制作染色体。第二次固定后也可静置至第二天，吸去部分上清液后，即可进行制片。

固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。

6 ．滴片：使用以高纯水制备的冰水片进行滴片。用吸管吸取细胞悬液，距玻片 5 厘米左右的距离滴片。每张载片滴 1--3 滴 ( 根据细胞悬液的浓度 ) 。滴片后斜放，室温中空气干燥。

亦可滴片后立刻用嘴轻轻吹片，可帮助细胞和染色体分散。

滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步，首先载片要非常于净，否则将含影响染色体的分散和分带的效果。其次，滴片的距离、滴加量的多少，制片的方式都会影响到染色体分散的效果。

7 ． Giemsa 染色：取 1--2 张片 ( 多数制片留下来做分带 ) 用约 3 毫升 Giemsa 染液进行扣

染。染液为 1 ／ 10 的 Giemsa 染液。染色 30 分钟后，自来水冲洗，凉干。

四、观察

1 ．在低倍和中倍镜下，观察分裂相的多少和染色体制片的质量。

2 ．寻找分散适宜，不重叠，收缩适中，染色体不过度分开，染色体“硬”的分裂相。

3 ．观察男性和女性的正常染色体制片，确定其性别。在正常情况下，人的 Y 染包体与 G 组的 2 个染色体相似，借助这一点可根据染色体的形态对性别作一初步的判断。

4 、选择实验者本人的一个有代表性分裂相，拍照后进行核型分析，并做出核型图。