第七章      细菌和噬菌体的遗传重组

遗传重组是把不同基因组中所含的遗传组分汇集到一个基因组中，从而产生亲代所没有的基因组合的过程。真核生物中的遗传重组，主要是通过染色体上的基因自由组合或交换实现的，它是生物有性生殖过程的一部分，形成的二倍性合子的遗传组分，一半来自父体，一半来自母体，基因的自由结合和交换是在两个交配亲体的整套染色体基因组间进行的。但原核生物（如细菌）的遗传重组就不象真核生物那样的完善和有规律性，因此有必要来学习一下原核生物的遗传重组，特别是经典的实验材料细菌和噬菌体。

1  细菌突变型及其识别方法

原核生物包括细菌、真菌、病毒。一个正常的（野生型的）基因突变为一个新的等位基因，如果蝇的红眼基因突变为白眼基因，叫做基因突变。带有突变基因并在表现型上显示出相对差异的个体叫突变型。人们通过大量突变型之间的杂交实验，经过多代的观察和分析，才认识了基因的功能。这种基因的遗传分析方法不仅常用来研究动、植物的遗传，也适用于研究细菌和病毒的遗传。

1.1  细菌的突变型

1907年，Massim首先分离出了6个大肠杆菌的突变品系，它们由于代谢上的缺陷而不能发酵乳糖。这种代谢上的缺陷只要利用特定的培养基就很容易被发现。能发酵乳糖的正常菌落在含伊红和甲基蓝的培养基（EMB）上长成的菌落是红色的，不能发酵乳糖的细菌则长成白色菌落。这种能把野生型和突变型明显地区分开来，便于人们进行选择的培养基叫做选择培养基。

利用EMB培养基还分离出了不能利用阿拉伯糖、甘露糖、木糖、麦芽糖作碳源的一批大肠杆菌突变型。由于它们在营养代谢上是有缺陷的，所以统称为营养缺陷型（anxotroph），而把正常的野生型叫做原养型（prototroph）。

原养型大肠杆菌对培养基中营养成分的要求是很简单的，只要有葡萄糖和一些无机盐就能生活了。这种能保持野生型生活的最低限度的培养基叫做基本培养基（minimal medium）。而营养缺陷型由于基因突变失去了自己制造某种物质（氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等）的能力，所以在营养上产生了特殊的要求，只有在基本培养基中补加它们所不能合成的某些物质才能生长、繁殖。这种补加一些营养物质的基本培养基叫做补充培养基（additive medium）。

因此，把营养缺陷型细菌接种在一系列分别附加有各种氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶的基本培养基上，就可以判断出每种营养缺陷型生长所需要的物质，从而进一步探知是控制哪一种物质合成的基因发生了突变。为简明起见，这些突变型的基因型可用它不能合成的物质名称来表示，取前三个字母并在右上角加一负号“－”或正号“＋”。“－”代表不能合成该物质的缺陷型，“＋”表示能合成该物质的野生型。

如：thr－,pro－,ade－,trp－分别代表苏氨酸、脯氨酸、腺嘌呤和色氨酸的缺陷型。

细菌的另一类突变型叫做抗药型。野生型细菌通常会被一定剂量的某种药物杀死，所以叫做药物敏感型，本世纪初在利用药物治疗细菌性疾病之后不久，就发现把一种细菌培养物用致死剂量的药物处理后，往往还有一些细菌不受药物的影响而存活下来，这是由于在原来的药物敏感型中，有一些细菌已转变为抗药型。20世纪40年代，随着各种抗菌素（青霉素、链霉素等）的广泛应用，细菌对药物发生抗性的现象越来越普遍。以后用青霉素，特别是链霉素做选择因素，在大肠杆菌中选出了一批抗青霉素和链霉素的抗药性突变型。它们的基因符号可用该药物名称的前三个字母并在右上角附加“r”来表示：Penr, Strr。与之相应的药物敏感型可写成Pens和Strs。

此外，在大肠杆菌中还发现有抗噬菌体突变型，它的细胞壁上由于没有T1噬菌体赖以附着的接受点，所以能抗T1噬菌体而不会被它杀死。它的基因型符号是Tonr。而野生型的大肠杆菌由于细胞壁上具有T1噬菌体的接受点，使噬菌体颗粒得以附着在它的壁上，因而能被侵入细胞内的噬菌体杀死，所以叫做T1噬菌体敏感型。

1.2  细菌的遗传重组

原核生物的遗传重组实质上是指受体中插入来自供体的遗传性不同的DNA片段，并把这种DNA片段或它的复本整合为受体基因组的一部分。受体的遗传重组可以通过三种途径来实现：

转化（transformation）：游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）

接合（conju gation）：通过供体与受体细胞之间的接触而传递DNA

转导（transduction）：一种细菌的DNA片段经过温和的或有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌

1.2.1 转化

已经发现不少属的细菌可以转化，如链球菌属，嗜血杆菌属，芽孢杆菌属，奈瑟氏球菌属，假单孢杆菌属以及大肠杆菌属。在细菌中转化很可能是十分普遍的现象。

能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞（competent recipient cell），在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子，可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶，它参与了DNA的吸收。

转化过程可分为几个步骤：

（1）双链DNA分子和细胞表面感受位点可逆性的结合；

（2）供体DNA片段被吸入受体细胞；

（3）侵入受体细胞的供体双链DNA转变成单链形式，其中的一条链被降解；

（4）未被降解的一条链部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，形成杂合的DNA分子；

（5）这种杂合的DNA复制后，形成一个亲代类型（受体）的DNA和一个重组类型（供体和受体）的DNA并导致转化细胞的形成与表达。

1.2.2  接合

A菌株中的质粒→F质粒（F因子）（独立染色体外可复制的因子为质粒），为一环状DNA，这种F因子有一个配对区，可和大肠杆菌染色体的某些区域配对（即与之同源），配对后即可交换，便整合到大肠杆菌染色体上。这种既可以整合又可以游离的质粒叫附加体。

F因子上大部分区域叫育性区或育性基因，负责大肠杆菌的育性。含有育性区的大肠杆菌在细胞表面有很多毛状的性纤毛（或性伞毛）。

原点：有育性区和配对区之间有原点。

含有游离状态的F因子叫F+，没有的叫F-，含有整合状态的叫Hfr（高频重组）。大量混合后，只有F+×F-，Hfr×F-能杂交，而F+×F+，F-×F-，Hfr×Hfr，Hfr×F+都不能杂交。因此大肠杆菌的和相当于高等植物的雌雄配子。

1.2.2.1  F+×F-

接合管的形成：菌株靠近→细胞膜融合→两细胞间形成接合管

F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移（因此叫滚环复制），复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F-变成F+。

1.2.2.2  Hfr×F-

F因子可整合在大肠杆菌不同的部位，由于整合的部位不同，方向不同，则形成了不同的Hfr。

杂交过程也是先形成接合管，然后Hfr边复制边转移，转移的顺序：原点—配对区—大肠杆菌基因—配对区—育性基因。但在转移过程中，结合管很易破裂，这样转移到受体的部分只是靠近原点的一部分（全部转移需温和条件120分钟），形成部分二倍体。部分二倍体：一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体。其中受体的基因组叫内基因子，供体的基因组叫外基因子。外基因子转移到受体以后：游离。随着细胞分裂代数的增加被稀释，消失；与内基因子发生交换、重组。奇数交换，形成一个线状分子，在大肠杆菌中不能复制，导致细胞死亡；偶数交换，形成线状分子（不能复制，消失）和环状分子。大肠杆菌复制时，DNA复制酶只能识别环状分子。其中原点有273bp，富含AT，首先解旋成“眼”状结构，然后双向复制。

1.2.3  大肠杆菌的重组与真核生物的不同

（1）基因重组发生在部分二倍体中（自然状态下很难把供体基因全部转移过来）

（2）奇数交换无效，偶数交换有效。

（3）只出现一种重组子（杂交后代），真核生物出现四种杂交后代。

（4）在F+×F-中，结果使F-变为F+，很少发生基因重组（供体与受体之间）

因为F+大部分是游离的，不转移，只有个别的细胞是整合状态。只有整合的才能转移，进行基因重组。

（5）在Hfr×F-中，F-很少变成F+，基因重组频率比较高。杂交后，育性基因没有转移。

2  大肠杆菌的基因定位——中断杂交法

人为的中断大肠杆菌杂交而进行的基因定位叫中断杂交法。

原理：

Hfr和F-一混合，马上形成接合管，然后进行转移，越接近原点的基因，进入受体就越快。用振荡器振荡使之中断，检测受体细胞中的供体基因。1分钟内出现了受体A基因，则说明A基因很近原点；2分钟内出现了受体AB基因，则说明B在A之后，也近原点；3分钟内出现了受体ABC基因，则说明C在AB之后，也近原点；则按时间来定位，标出不同基因位于原点的先后位置，单位：时间单位。据基因进入受体的时间来定位基因（假定转移是匀速的）。

方法：

苏氨酸  亮氨酸  叠氮化钠  噬菌体  乳糖  半乳糖  链霉素

Hfr：   thr+     leu+     azir       tonr
lac+    gal+     strs

F-：　  thr-      leu-     azis       tons    lac-    gal-     strr

将 Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中，一定时间取样振荡，洗涤完全培养基，加至添加str的基本培养基（葡萄糖和无机盐）上，只能使杂交后代生长，再把菌落分别转移到只添加azi、T1、gal或str的选择性培养基上。

azi   T1
gal
str

8min    －    －    －    －

9min    ＋    －    －    －

11min   ＋    ＋    －    －

18min   ＋    ＋    ＋    －

25min   ＋    ＋    ＋    ＋

箭头表示基因位点位置先后

大肠杆菌只要有葡萄糖（G）则不利用其它糖类，因此基本培养基中lac+ 、lac-都能生长。选择培养基中gal或lac只用其做碳源，没有其它糖（碳源）。

Hfr菌株的名称
测定基因的顺序

A
1    11    10     9     8     7

B
3     4     5     6     7     8

C
4     3     2     1    11    10

D
7     8     9    10    11     1

E
9     8     7     6     5     4

一个菌株只能测少数（如6个）基因，接合管便断裂。

3  转导

以噬菌体作为媒介，把某一细菌的DNA转移到另一细菌，进行基因重组的过程叫转导。与杂交的区别：媒介不同（杂交是F因子，转导是噬菌体）。转导分为局限性转导和普遍性转导两类。局限性（特异性）转导(温和性噬菌体介导)；温和噬菌体：λ、MU、MB噬菌体。

3.1  局限性转导

λ噬菌体吸附在大肠杆菌表面，头部线状DNA被注入寄主后，DNA首先环化。  游离状态的环化DNA复制（滚环型复制）形成许多线状DNA，然后包装，最后释放出新的噬菌体，大肠杆菌被裂解——裂解生长。环化DNA整合在大肠杆菌染色体的两个基因（bio+和gal）之间，整合状态的噬菌体叫原噬菌体（或前噬菌体），或叫没有侵染能力的噬菌体。含有原噬菌体的菌叫溶原化菌。在某些因素作用下原噬菌体还可从大肠杆菌染色体上剔除下来。

λ噬菌体浸染含有bio+和gal+的大肠杆菌，整合，剔除时偏向一端（不正常的剔除），裂解生长包装，释放出多个转导噬菌体（携带大肠杆菌基因），再浸染gal-的受体，转导噬菌体进入寄主后环化，（此时称为部分二倍体，表型gal+，可发酵半乳糖。λ噬菌体DNA游离不整合，噬菌体不能复制，最后消失，但大肠杆菌表型由gal+变为gal-；λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体中，表型为gal+，整合的λ噬菌体还可游离出来。
λ噬菌体与大肠杆菌染色体上的gal-基因交换（基因两端双交换），新的含gal-基因的λ噬菌体不能复制最后消失，大肠杆菌表型为gal+。

提供基因的叫供体，接受基因的叫受体。提供基因的噬菌体为转导噬菌体，接受了基因的受体叫转导子。

仅能转移供体的个别的特定的少数的基因（只能转移整合部位两侧的基因）为局限性，仅能转移少数特定基因的转导叫局限性转导。

3.2
普遍性转导（由烈性噬菌体介导）

烈性噬菌体浸染含基因的大肠杆菌，噬菌体DNA进入寄主后环化，水解寄主的染色体，合成的蛋白质外壳误包装了寄主的一段DNA，形成含基因转导噬菌体。当它再浸染含基因的寄主时，在基因的两端双交换，使寄主变为。这种转导供体的任何一个基因都可能被转移，且几率相等，因此称普遍性转导。

定义：没有特异性的转导叫普遍性转导。

3.3  转导的特点

（1）转导是以噬菌体为介导的；

（2）重组发生在部分二倍体中；

（3）只出现一种重组子，不出现相反的重组子（如gal-消失，只剩下gal+）。

4
噬菌体遗传分析

噬菌体是指浸染细菌、放线菌以及真菌的病毒。包括温和、烈性两种，都没有细胞结构，由一个蛋白质外壳包围一段DNA或RNA（烟草花叶病毒为RNA病毒）。

4.1
性状（突变型）

快速溶菌突变型（噬菌体裂解寄主的过程叫溶菌）：少量T系列噬菌体（如T2）和大量大肠杆菌混合，涂于固体平板，噬菌体裂解速度越快，出现的噬菌斑越大。野生型r+噬菌斑小，快速生长突变型r-噬菌斑大。

寄主范围突变型：野生型T2只能浸染B菌株，不能感染B2菌株（用h+表示）；T2突变为T2-，产生抗性突变？，既能浸染B菌株，也能浸染B2菌株（用h-表示）。当在含有B/B2的固体培养基上接种h+后，出现半透明的噬菌斑；而接种h-后，出现透明的噬菌斑。

30’溶菌
20’溶菌

基因型
r+
r-

表现型     噬菌斑小        噬菌斑大

T1r表示对T1噬菌体产生抗性的大肠杆菌。

4.2  噬菌体的基因重组 h+r- × h-r+

将大量噬菌体h+r-和大量噬菌体h-r+加入含有大肠杆菌B的完全培养基。两种噬菌体混合造成复感染（一个大肠杆菌中同时进入两种噬菌体）。将大肠杆菌滤下来，收集噬菌体（加氯仿振荡），将少量噬菌体再涂于含有大肠杆菌B和B2菌株的固体培养基中，出现噬菌斑，除预期的半透明大噬菌斑（h+r-浸染造成）和透明小噬菌斑（h-r+浸染造成）外，还出现了半透明小噬菌斑和透明大噬菌斑两种表型。

这是因为T2噬菌体为烈性噬菌体，当两种T2噬菌体复感染大肠杆菌B时，不和大肠杆菌染色体整合，而在两种噬菌体h、r基因之间和一个基因外侧发生了双交换（单交换后形成一个环，不能复制而死掉），结果形成四种噬菌体h+r-、h-r+、h+ r+和h- r-（后两种为重组类型）。

B菌株B2菌株培养基是鉴别噬菌体性状的工具（如同解剖镜是观察果蝇的工具）。